摘要：本研究旨在利用交联酶聚集体（cross-linked enzyme aggregates， CLEAs）技术固定化瘤胃球菌来源的D-阿洛酮糖-3-差向异构酶（D-allulose-3-epimerase from Ruminococcus sp.， RDAE）。选择聚乙二醇PEG4000作为沉淀剂、葡聚糖醛作为交联剂，通过优化沉淀剂用量、交联剂用量与交联时间制备交联聚集体RDAE-CLEAs。比较游离酶RDAE与固定化酶RDAE-CLEAs的酶学性质差异，并采用扫描电镜、红外光谱和分子动力学模拟分析固定化前后酶的结构变化。在不添加稳定剂的条件下，研究采用36%（w/v）PEG4000与2.73 mg/mL葡聚糖醛交联反应4 h制备的RDAE-CLEAs酶活保留率达到55.88%。与游离酶相比，固定化酶在pH6.0-7.5和30-60℃下的环境耐受性显著提升（P<0.05），重复使用10次后仍能保持59.77%的初始活性。结构分析显示RDAE在交联过程中发生了明显的构象变化，酶蛋白四聚体结构中的亚基结合紧密程度降低。研究获得了重复使用性能良好的RDAE-CLEAs，揭示了RDAE表面赖氨酸残基不仅为共价交联提供有效位点，还在维持酶蛋白四聚体刚性结构中发挥关键作用。基于四聚体刚性结构对RDAE热稳定性的重要影响，在避免破坏酶蛋白表面赖氨酸残基基础上开发新的交联策略对提高RDAE-CLEAs应用潜力具有积极意义。
文章目录
1 材料与方法
1.1 材料与仪器
1.2 实验方法
1.2.1 RDAE粗酶制备
1.2.2 葡聚糖醛的制备
1.2.3 RDAE交联酶聚集体（RDAE-CLEAs）制备
1.2.4 RDAE交联酶聚集体（RDAE-CLEAs）优化
1.2.4.1 沉降条件优化
1.2.4.2 交联剂用量优化
1.2.4.3 交联时间优化
1.2.5 酶活力测定
1.2.6 酶学性质分析
1.2.7 重复使用性测试
1.2.8 扫描电镜观察
1.2.9 红外光谱
1.2.10 分子动力学模拟
1.3数据处理
2 结果与分析
2.1 RDAE-CLEAs制备优化
2.2 RDAE-CLEAs酶学性质分析
2.3 RDAE-CLEAs结构表征研究
2.4 RDAE-CLEAs的分子动力
