摘要：本研究以芡实为基质，构建纳豆芽孢杆菌（Bacillus subtilis var.natto）与米曲霉（Aspergillus oryzae）混菌共培养体系，通过多尺度优化制备高活性抗氧化肽。基于Box-Behnken响应面法建立三因素优化模型，确定最佳工艺参数：复合菌种接种量9.7%、菌种体积比2.2∶1（B.subtilis∶A.oryzae）、发酵时间（73±0.5） h。验证实验显示：多肽得率为（73.72±0.13）%、蛋白酶活力为（198.79±0.94） U·mL-1。结构鉴定结果显示：功能氨基酸组分中抗氧化类（Cys/Met/His）占比66.24%、疏水性氨基酸占50.06%、芳香族氨基酸占11.82%。分子量≤1 kDa的E1组分呈现显著抗氧化特性：对DPPH·清除率为（87.78±0.79）%(IC50=0.082mg/mL)、对ABTS+·清除率为（98.79±1.26）%(IC50=0.017 mg/mL)，较GSH提升10.5%（P<0.01）；铁还原活性：700 nm吸光度0.688±0.001(IC50=1.97 mg/mL)，效能指数(REC=0.58 mL·mg-2)提升2.3倍；MALDI-TOF/TOF质谱鉴定得到9种特征性抗氧化肽（411.37?1032.07 Da），核心基序含Pro-Arg-Trp结构域（占比68%），其中新型肽段IPILRW（m/z 743.382+）与Keap1蛋白结合能ΔG=-32.6 kcal·mol-1。本研究通过解析芡实多肽氨基酸指纹特征与构效关系，为工业化生产植物源抗氧化剂提供理论依据。
