摘要：目的 基于中药活性成分筛选具有抗幽门螺杆菌脲酶（Helicobacter pylori urease, HPU）活性的天然小分子化合物,系统探讨其抑制机制及对幽门螺杆菌（Helicobacter pylori, Hp）感染后细胞炎症与氧化应激的调节作用。方法 采用多维度筛选策略,首先基于HPU晶体结构在中药单体数据库中进行计算机虚拟筛选,结合文献计量学分析优选候选分子。随后采用改良Berthelot比色法进行体外脲酶活性抑制实验验证。通过Lineweaver-Burk双倒数曲线分析酶抑制动力学特征。利用巯基阻断剂和活性中心Ni2+竞争抑制剂探究抑制位点,采用Auto Dock Vina 1.2. 3软件进行分子对接。建立Hp感染人胃黏膜上皮细胞（human gastric mucosal epithelial cells, GES-1）模型,通过CCK-8法和乳酸脱氢酶释放实验评估化合物细胞毒性,采用实时荧光定量聚合酶链反应（quantitative real-time polymerase chain reaction, q RT-PCR）检测白细胞介素（interleukin,IL）-6、IL-8和IL-1β的m RNA表达水平,应用2',7'-二氯二氢荧光素二乙酸酯（2',7'-dichlorodihydrofluorescein diacetate,DCFH-DA）荧光探针检测细胞内活性氧（reactive oxygen species, ROS）水平。结果 筛选结果显示,天然小分子化合物红景天素（rhodiosin, RHO）具有显著的抑酶活性,其半数抑制浓度（half-maximal inhibitory concentration, IC50）为（82.38±5.45）μmol/L。酶动力学分析表明RHO对HPU的抑制呈现反竞争性抑制特征,抑制常数Ki为（146.40±2.19）μmol/L,RHO-巯基/Ni2+-HPU相互作用实验证实其作用靶点位于HPU活性中心的巯基,分子对接显示RHO特异性结合于HPU活性口袋的Flap结构域,结合能为-8.678 kcal/mol。细胞实验表明,在80μmol/L及以下浓度范围内,RHO对GES-1无显著毒性,并能显著抑制Hp诱导的IL-6、IL-8和IL-1β m RNA过表达,同时使Hp诱导的ROS生成减少95%。结论 中药单体RHO以反竞争性抑制的形式靶向HPU活性中心的巯基位点发挥抑酶作用,并能有效缓解Hp感染引发的胃黏膜上皮细胞炎症反应和氧化应激损伤,为开发新型抗Hp治疗策略提供理论依据。
