摘要：采用转录组学分析结合细胞实验验证探讨异槲皮苷（isoquercitrin，IQC）治疗实验性类风湿关节炎（rheumatoid arthritis，RA）的机制。首先通过网络药理学预测IQC及RA的潜在作用靶点，再结合脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）诱导的RAW 264.7细胞炎症模型进行IQC的有效浓度筛选及IQC治疗RA的潜在作用靶点转录组学分析，并将两种方法分析得到的三个靶点库进行交集获得核心靶点，随后使用AutoDock分子对接等软件，验证IQC与核心靶点之间的结合能力。最后，采用LPS分别诱导RAW 264.7细胞和成纤维样滑膜细胞（fibroblast-like synoviocytes，FLS）构建炎症模型进行验证。网络药理学结果表明IQC有230个潜在靶点、RA疾病有2 980个靶点，转录组学测序分析鉴定出101个显著差异表达基因，经交集分析最终确定酪氨酸蛋白激酶受体TYRO3（tyrosine-protein kinase receptor TYRO3，TYRO3）为关键作用靶点，且IQC与TYRO3的结合能为-7.1 kcal/mol。细胞实验结果表明IQC有效浓度为0.25～25 μmol/L，且IQC能够抑制RAW 264.7细胞内活性氧（reactive oxygen species，ROS）的积累。实时荧光定量PCR和蛋白免疫印记结果显示，IQC可以通过抑制RAW 264.7细胞中TYRO3 mRNA水平显著下调白细胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）、IL-6、诱导型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）等促炎因子基因表达水平及显著上调精氨酸酶-1（arginase-1，ARG-1）、IL-10等抑炎因子基因表达水平，显著下调TYRO3、IL-1β、肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）蛋白表达量，显著上调IL-10蛋白的表达量，达到抑制RAW 264.7细胞炎症反应的作用；此外，IQC可以显著抑制FLS细胞的迁移侵袭能力以及显著下调FLS细胞中基质金属蛋白酶-1（matrix metalloproteinase-1，MMP-1）、MMP-3、MMP-9、IL-1β、IL-6、TNF-α mRNA表达水平及TYRO3和MMP-9的蛋白表达量，达到抑制滑膜成纤维细胞的炎症反应以及侵袭能力的作用。综上所述，IQC可能通过调控TYRO3受体信号缓解巨噬细胞炎症，阻断成纤维细胞异常活化的关键通路，从而发挥多靶点抗RA作用。
文章目录
1 材料与方法
1.1 试剂与仪器
1.1.1 细胞株和主要试剂
1.1.2 主要仪器
1.2 实验方法
1.2.1 网络药理学筛选IQC和RA共同作用靶点及靶点的富集分析
1.2.2 RAW 264.7和FLS细胞培养
1.2.3 CCK8法筛选IQC有效浓度
1.2.4 转录组测序分析不同实验组间的差异表达基因
1.2.5 分子对接验证IQC与关键靶点蛋白的结合作用
1.2.6 RT-qPCR法检测RAW 264.7中炎症相关因子mRNA的表达
1.2.7 流式细胞术检测RAW 264.7细胞中ROS含量
1.2.8 Western blot检测RAW 264.7细胞中炎症相关蛋白表达水平
1.2.9 CCK-8检测FLS细胞增殖
1.2.10 Transwell实验检测FLS的迁移能力
1.2.11 RT-qPCR检测FLS细胞迁移和炎症相关因子mRNA表达水平
1.2.12
1.3 统计学分析
2 结果
