目的:建立威灵仙及其掺伪品升麻的双重Taq Man探针实时荧光PCR鉴别方法。方法:以psb A-trnH序列为基础,分别设计威灵仙和升麻的特异性引物和探针,通过筛选和优化引物浓度、探针浓度、退火温度等主要条件,建立双重Taq Man探针实时荧光PCR反应体系;同时对该方法的精密度、重复性、特异性、灵敏度、掺伪量检测限等指标进行了专项考察,并对混合样品进行了可行性验证。结果:所建立的方法检测威灵仙的精密度试验平均Ct值为22.070,RSD为1.53%,检测升麻的精密度试验平均Ct值为19.438,RSD为1.44%;威灵仙重复性试验平均Ct值为22.800,RSD为2.30%,升麻重复性试验平均Ct值为19.280,RSD为1.89%;在浓度为0.0288～90 ng/μL的范围内,线性关系良好,威灵仙线性方程为y=-3.7703x+22.233,相关系数为0.9967,升麻的线性方程为y=-3.9525x+21.447,相关系数为0.9988;当二者相互掺入的比例低至1%时,仍可获得典型的荧光扩增曲线。结论:该研究建立的双重Taq Man探针实时荧光PCR方法可有效检出威灵仙和升麻,为威灵仙药材的质量控制提供了专属性更强、灵敏度更高的检测方法。
