摘要：[目的] 旨在探究H3N2犬流感病毒（canine influenza virus， CIV）血凝素（HA）蛋白K156E和神经氨酸酶（NA）蛋白R201K位点突变对病毒复制能力的影响及机制。[方法] 以CIV毒株A/Canine/Jiangsu/06/2010（简称06）为研究对象，通过反向遗传技术拯救野毒株06，单位点突变株06-HAK156E、06-NAR201K以及双位点突变株06-HAK156E/NAR201K，分析其在MDCK、A549细胞上的复制能力，检测HA蛋白K156E和NA蛋白R201K位点突变后影响流感病毒复制周期中的具体环节，包括吸附、内化、酸化和膜融合以及出芽过程等。[结果] 3个位点突变株06-HAK156E、06-NAR201K和06-HAK156E/NAR201K在2种细胞上的复制能力均显著增强，其中双位点突变株06-HAK156E/NAR201K复制能力增强最为显著。2个位点突变后对HA裂解活性、酸稳定性以及糖基化修饰均没有影响，但HA蛋白K156E突变后其结合唾液酸受体的特性发生改变，NA蛋白R201K位点突变后NA活性提高。[结论] HA蛋白K156E和NA蛋白R201K位点突变均能促进CIV复制，06-HAK156E增强CIV的唾液酸受体结合特性，06-NAR201K提高CIV的神经氨酸酶活性。
文章目录
1 材料与方法
1.1 毒株、细胞和鸡胚
1.2 试剂
1.3 引物
1.4 方法
1.4.1 病毒基因表达质粒构建
1.4.2 反向遗传学技术拯救病毒
1.4.3 空斑试验
1.4.4 病毒一步生长曲线
1.4.5 HA蛋白裂解活性
1.4.6 HA蛋白酸稳定性
1.4.7 病毒纯化
1.4.8 HA和NA蛋白的糖基化修饰
1.4.9 吸附试验
1.4.10 子代病毒粒子的释放
1.4.11 NA活性检测
1.5 统计分析
2 结果
2.1 利用反向遗传技术构建位点突变病毒
2.2 重组病毒在细胞水平上的复制能
