摘要：为了建立猫星状病毒（FAstV）的血清抗体检测方法，本研究从猫粪便拭子中筛查并克隆FAstV ORF2基因。通过原核表达技术成功表达了衣壳蛋白截短体CapA的重组蛋白，以纯化后的CapA重组蛋白作为包被抗原，建立了FAstV血清抗体间接ELISA检测方法，并对临床血清样本进行检测。结果显示：CapA蛋白在E.coli BL21（DE3）中以可溶性蛋白形式表达其大小约65 kDa；免疫新西兰大白兔制备的多克隆抗体经间接免疫荧光试验验证，可特异性识别FAstV。建立的间接ELISA方法经系统优化，确定最佳条件为：10 μg/mL抗原包被（37℃孵育2 h），1﹕100血清稀释（37℃ 1 h），1﹕20 000 HRP-二抗（37℃ 45 min）。该方法具有高灵敏度（检测限1﹕3 200）和特异性（与猫杯状病毒、猫冠状病毒等无交叉反应），重复性良好（批内批间变异系数均小于10%）。用该方法对广西217份猫血清样本进行检测，结果显示，FAstV抗体的阳性率为11.06%，证实了该检测体系的实用价值。本研究首次报道的FAstV CapA蛋白多抗及ELISA检测方法为FAstV的分子机制研究和流行病学监测提供了重要技术支撑。
文章目录
1 材料和方法
1.1 实验动物和血清
1.2 主要试剂和载体
1.3蛋白结构预测
1.4引物的设计与合成
1.5目的基因扩增及重组质粒构建
1.6重组CapA蛋白表达、纯化及Western blot鉴定
1.7多克隆抗体的制备及效价测定
1.8 多克隆抗体的IFA鉴定
1.9间接ELISA方法的建立
1.9.1 反应条件的优化
1.9.2 临界值确定
1.9.3 特异性试验
1.9.4 敏感性试验
1.9.5 重复性试验
1.9.6 临床应用
2 结果
2.1 CapA蛋白结构预测结果
2.2 目的基因扩增及双酶切鉴定
2.3 重组蛋白的表达、鉴定及纯化
2.4 多克隆抗体的效价测定
2.5 多克隆抗体的IFA鉴定结果
2.6 间接ELISA方法反应条件优
