当前H5N1亚型禽流感疫情在全球范围内肆虐，且病毒不断变异，因此需要持续对检测方法的有效性进行评估。近年来，我们在临床样品检测过程中发现，国家标准《高致病性禽流感诊断技术》（GB/T 18936-2020）中H5亚型高致病性禽流感病毒实时荧光RT-PCR方法存在扩增曲线荧光值偏低的现象，对结果判定产生一定干扰。基于国标引物和探针序列与当前流行毒株的匹配性评估分析，我们设计和优化了上游引物和探针序列，并对优化方法的特异性、灵敏度和临床样品检测效果与国标方法进行了对比。结果显示，该优化方法特异性强，与其他亚型AIV和常见禽类病原体均无交叉反应；针对2.3.4.4b分支H5亚型病毒的检测灵敏度较国标方法提高了10倍，针对2.3.4.4h分支H5亚型病毒的检测灵敏度与国标方法类似；组内和组间试验Ct值变异系数介于0.17%～1.58%，具有良好的重复性；对48份家禽和野禽咽肛拭子样品检测，本优化方法检出阳性样本38份（国标方法检出37份），其中64.9%(24/37)阳性样品的Ct值较国标方法低2以上。结果表明，本研究优化的荧光RT-PCR方法可为H5亚型高致病性禽流感病毒的流行病学调查监测及快速诊断提供技术支持。
