摘要：目的 探究不同成骨诱导方法对人源瓣膜间质细胞(human valvular interstitial cells, hVICs)成骨分化及钙化的影响。方法 选取常用的5种体外成骨诱导瓣膜间质细胞方法对hVICs进行成骨诱导分化:(1) 2 mmol/L无机磷酸盐+50μg/mL维生素C(2 mmol/L Pi+VC);(2) 2.6 mmol/L无机磷酸盐(2.6 mmol/L Pi);(3) 2.5 mmol/L无机磷酸盐+2.7 mmol/L氯化钙+50μg/mL维生素C(2.5 mmol/L Pi+Ca+VC);(4) 10 mmol/Lβ-磷酸甘油+10 nmol/L地塞米松+8 mmol/L氯化钙+4μg/mL维生素D3(β-GP+DXM+Ca+VD3);(5) 10 mmol/Lβ-磷酸甘油+10 nmol/L地塞米松+50μg/mL维生素C(β-GP+DXM+VC)。通过茜素红染色、RT-qPCR和Western blotting分别对钙化沉积和成骨标志物的表达进行评估。结果 通过比较5种诱导方法在成骨诱导第4、7、10、14 d的钙沉积面积,发现2 mmol/L Pi+VC、β-GP+DXM+Ca+VD3和β-GP+DXM+VC在前10 d几乎没有钙化,而2.6 mmol/L Pi在第7天出现明显钙化,2.5 mmol/L Pi+Ca+VC在诱导第4天便出现明显钙化,且在第7天时几乎全部发生钙化。在第14天时,除2 mmol/L Pi+VC钙化较少外,其余方法均发生明显钙化。成骨标志物检测显示,碱性磷酸酶在2 mmol/L Pi+VC、2.6 mmol/L Pi和β-GP+DXM+VC诱导第7天时显著上调(P<0.05);而骨桥蛋白在诱导第7天时均显著上调(P<0.001)。随后对2.5 mmol/L Pi+Ca+VC中的3种组分两两组合进行钙化诱导,发现Pi+Ca和Pi+Ca+VC在诱导第7天时钙化面积显著多于Pi+VC和Ca+VC,但ALP表达显著低于Pi+VC和Ca+VC,提示这种钙沉积可能是由于无机磷酸盐与氯化钙发生反应生成了磷酸钙沉淀。结论 2.6 mmol/L Pi和β-GP+DXM+VC诱导hVICs成骨分化的效果最佳。
文章目录
1 资料与方法
1.1 资料
1.1.1 资料来源
1.1.2 主要试剂
1.1.3 主要仪器
1.2 方法
1.2.1 细胞培养方法
1.2.2 成骨诱导方法
1.2.3 茜素红染色检测钙沉积
1.2.4 采用RT-qPCR法检测ALP和SPP1的mRNA表达
1.2.5 采用Western blotting法检测ALP和OPN的蛋白表达
1.3 统计学处理
2 结 果
2.1 钙沉积面积检测
2.2 成骨标志物的检测
2.3 2.5 mmol/L Pi+Ca+VC组的钙化是产生磷酸钙沉淀的结果
3 讨 论
