摘要：毕赤酵母（Komagataella phaffii）是一种天然的甲基营养真核微生物，能以甲醇为唯一碳源进行生长代谢，常用于生产蛋白和各种代谢产物，但其内源代谢途径的甲醇利用效率有待进一步提高。该研究过表达磷酸戊糖途径非氧化支路的转酮醇酶（transketolase， tkt）、核糖-5-磷酸-3-差向异构酶（ribulose-5-phosphate-3-epimerase， rpe）和果糖二磷酸酶（fructose-1，6-bisphosphatase， fba）的编码基因，以促进甲醇的同化代谢。结果表明，tkt-GS115生物量OD600提升约1.7%，其最大比生长速率μ达到0.23 h-1；与对照菌株Δfldh相比，fba-Δfldh以最大比生长速率μ为0.23 h-1提前18 h进入生长阶段；rpe-Δfdh和fba-Δfdh逆转了其亲本菌株Δfdh不能在甲醇基本培养基中生长的表型，其中rpe-Δfdh展现出巨大的生长潜力，最高生物量OD600达到6.97，而fba-Δfdh的最大比生长速率μ高达0.36 h-1。各重组菌株的甲醇利用率因出发菌不同而存在差异：tkt-GS115、tkt-Δfldh、fba-Δfldh的甲醇利用效率分别提高0.017、0.007、0.034。该研究通过加强PPP非氧化支路的3个关键基因，有效提升了K. phaffii重组菌的甲醇代谢能力。
文章目录
1 材料与方法
1.1 菌株和质粒
1.2 培养基
1.3 重组载体与菌株的构建
1.3.1 重组载体的构建
1.3.2 过表达菌株的构建与筛选
1.4 生长曲线的测定
1.5 实时荧光定量PCR
1.6 甲醇残量测定
2 结果与分析
2.1 过表达菌株的表型验证
2.2 比生长速率分析
2.3 甲醇含量测定方法的可靠性分析
2.4 重组菌株的甲醇消耗量分析
2.4.1 以GS115为出发菌的重组菌株甲醇利用效率分析
2.4.2 以Δfldh为出发菌的重组菌株甲醇消耗量分析
2.4.3 以Δfdh为出发菌的重组菌株甲醇消耗量分析
2.5 甲醇同化效率分析
2.6 过表达rpe，tkt和fba后的转录水平分析
3 结论与讨论
