摘要：【目的】筛选青霉素G （penicillin G， PENG）降解菌并解析其分解代谢的关键酶，为青霉素菌渣的生物处理提供菌种和基因资源。【方法】以青霉素G钾（penicillin G potassium， PGK）为底物，通过富集培养筛选利用其为唯一碳源生长的菌株；结合基因组和转录组鉴定分解代谢的关键酶并分析其进化起源；表达和纯化关键酶，解析其酶促反应动力学参数；通过基因敲除和回补揭示关键基因在细菌利用PGK生长过程中的生理功能。【结果】获得的代尔夫特菌属（Delftia sp.） PG-8能降解并利用PGK为唯一碳源生长，且在pH 7.0、35 ℃、底物为10 mmol/L时表现出最佳的底物降解和细菌生长效果。PgkA能催化PGK快速降解[Km=（99.19±19.45） μmol/L，kcat/Km=（1.96±0.55）×105 L/（mol·s）]，而且相比完成功能鉴定的β-内酰胺酶，PgkA具有独特的进化起源。PgkB也能催化PGK降解，但其对底物的亲和力只有PgkA的1/5，且底物催化效率也较低。菌株PG-8-ΔpgkA和PG-8-ΔpgkB降解和利用PGK生长的能力都显著下降，且PG-8-ΔpgkA的能力下降的更明显。虽然同时敲除了pgkA和pgkB的PG-8ΔpgkAB还能降解一定量的底物，但是不能利用PGK为唯一碳源生长。【结论】PG-8是Delftia属中第一株利用PGK为唯一碳源生长的菌株，pgkA和pgkB在PG-8利用PGK为唯一碳源生长过程中都具有重要的生理功能，但是pgkA起主导作用。
文章目录
1 材料与方法
1.1 培养基
1.2 引物、质粒、菌株与培养条件
1.3 菌株的筛选和鉴定
1.4 生物转化分析
1.5 基因组和转录组测定
1.6 蛋白表达与纯化
1.7 酶学分析和产物鉴定
1.8 高效液相色谱(High Performance Liquid Chromatography， HPLC)和液相色谱-质谱联用仪(Liquid Chromatograph Mass Spectrometer， LC-MS)分析
1.9 pgkA和pgkB的基因敲除和回补
1.10 菌株和基因序列编号
2 结果与分析
2.1 Delftia sp. PG-8的筛选和鉴定
2.2 PG-8对PGK的降解特性研究
2.2.1 不同pH对底物降解和细菌生长的影响
2.2.2 不同温度对菌株PG-8降解PGK的影响结果
2.2.3 不同PGK初始浓度对底物降解和细菌生长的影响
2.3 生物转化和中间代谢产物的鉴定
2.4 参与PGK降解的基因的鉴定及进化分析
2.5 PgkA和PgkB的表达纯化和酶活性分析
2.6 基因敲除和回补验证pgkA和
