摘要：菌株对1，4-丁二胺耐受性低是1，4-丁二胺高产的技术瓶颈之一，提高菌株对1，4-丁二胺的耐受性是构建高产1，4-丁二胺工程菌株需要解决的主要问题。巴氏葡萄球菌326180菌株展现出了优异的高浓度1，4-丁二胺耐受性，不仅可以作为研究1，4-丁二胺耐受机制的理想模型，还可以为构建1，4-丁二胺高产工程菌株提供新的宿主选择。无论是耐受机制研究还是底盘菌株改造，都需要在分子水平上对巴氏葡萄球菌进行基因编辑。为了建立一套巴氏葡萄球菌遗传操作系统，为后续耐受机制研究和底盘菌株改造奠定基础，本研究系统优化了电转化条件，涵盖了菌株生长期、电场强度、电击缓冲液和复苏培养基等关键参数，成功建立了巴氏葡萄球菌电转化方法。同时，通过替换抗性表达盒，构建了基因编辑质粒pCpfOA；优化了基因编辑的筛选标记，建立了基于CRISPR/Cpf1的巴氏葡萄球菌基因编辑技术，编辑效率达到90%以上。本研究建立的巴氏葡萄球菌遗传操作系统为该菌的耐受机制研究以及底盘菌株的遗传改造提供了重要技术支撑。
文章目录
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
1.1.1 菌株和质粒
1.1.2 主要试剂与工具酶
1.1.3 培养基和相关溶液配制
1.2 实验方法
1.2.1 质粒的提取
1.2.2 感受态细胞制备
1.2.3 电转化
1.2.4 PCR引物设计
1.2.5 转化效率计算
1.2.6 sgRNA质粒和供体片段的构建
1.2.7 CRISPR/Cpf1系统基因编辑
2 结果与分析
2.1 电转条件优化
2.1.1 生长期对转化效率的影响
2.1.2 电场强度对转化效率的影响
2.1.3 电击缓冲液对转化效率的影响
2.1.4 复苏培养基对转化效率的影响
2.2 巴氏葡萄球菌CRISPR/Cpf1基因编辑技术的建立
2.2.1 抗性筛选标记的构建和验证
2.2.2 sgRNA质粒和供
