摘要：为提升新型农用抗生素诺沃霉素的产量，以链霉菌（Streptomyces sp.）HBERC-20821为材料，分别利用5种启动子ermEp、kasOp、kasOp3、kasOp*和SP44-SR12构建工程菌株，利用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）验证透明颤菌血红蛋白基因（vgb）的表达及其在不同启动子介导下的表达量差异，并通过摇瓶平行发酵试验筛选出诺沃霉素产量最高的工程菌株。利用一氧化碳差示光谱法检测所筛选菌株中功能性蛋白VHb的生物活性，并将所筛选的工程菌株与原始菌株进行发酵罐平行发酵培养，探究不同启动子介导的vgb基因异源表达对诺沃霉素产量的影响。结果表明，试验成功构建了含有不同启动子的5种工程菌株，在kasOp系列启动子介导下，vgb基因表达量显著高于传统ermEp启动子，提升幅度可达9～35倍，其中kasOp3启动子介导的vgb基因表达量最高，为ermEp启动子的35倍。在摇瓶平行发酵培养中，原始菌株HBERC-20821诺沃霉素产量为545.01 mg/L，kasOp启动子介导下的工程菌株20821-kasOp-vgb（20821/PKV）诺沃霉素产量最高，较原始菌株提高46.30%，产量达到797.30 mg/L；一氧化碳差示光谱试验证实工程菌株20821/PKV中VHb蛋白具有生物活性，其与一氧化碳形成的复合物在420 nm波长处展现出特征吸收峰。发酵罐平行发酵培养试验显示，原始菌株诺沃霉素产量为 495.67 mg/L，工程菌株20821/PKV诺沃霉素产量较原始菌株提高62.04%，产量达到803.18 mg/L。综上，在kasOp启动子的介导下，工程菌株20821/PKV诺沃霉素产量得到有效提升。
文章目录
1 材料和方法
1.1 材料
1.1.1 供试菌株、质粒和引物
1.1.2 培养基和抗生素
1.1.3 主要仪器和试剂
1.2 方法
1.2.1 含vgb基因的整合质粒构建
1.2.2 属间接合转移及菌液PCR验证
1.2.3 vgb基因的表达鉴定
1.2.4 摇瓶平行发酵培养
1.2.5 vgb基因在E. coli BL21中的诱导表达
1.2.6 VHb蛋白生物活性测定
1.2.7 发酵罐平行发酵培养
1.2.8 诺沃霉素产量检测
2 结果与分析
2.1 重组质粒的构建
2.2 5种工程菌株的菌液PCR验证
2.3 vgb基因的表达鉴定
2.4 摇瓶平行发酵培养与诺沃霉素检
