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摘要：【目的】利用合成生物学技术构建益生菌大肠杆菌Nissle 1917 （Escherichia coli Nissle 1917， ECN），使其能够特异性定植于肿瘤组织，原位转化肿瘤微环境中的葡萄糖及代谢废物氨，同步合成光敏剂前体5-氨基乙酰丙酸（5-aminolevulinic acid， 5-ALA）和免疫调节氨基酸精氨酸，并与免疫检查点抑制剂形成协同抗肿瘤效应。【方法】在ECN中共表达hemAM、hemL和argA基因，通过λ-Red同源重组系统敲除thyA基因以增强肿瘤靶向性；采用摇瓶发酵实验、紫外分光光度法、HPLC等方法检测工程菌ECN合成5-ALA和精氨酸的产量；进一步利用体外细胞实验和小鼠肿瘤模型系统评价工程菌ECN对结直肠癌细胞的作用。【结果】工程菌中5-ALA和精氨酸的产量分别达到（173±11.46） mg/L和（1.7±0.09） g/L，较野生型提高8.2倍和20倍（P<0.000 1）。thyA基因缺失使工程菌只能在肿瘤细胞HCT116和CT26中增殖，与正常组织细胞Vero相比，工程菌在肿瘤细胞中的OD600提高了1倍（P<0.000 1），进而提高工程菌ECN的肿瘤靶向性。体内外实验证实工程菌可在肿瘤组织中持续合成5-ALA和精氨酸，与野生型ECN相比，工程菌分别诱导CD8+和CD4+ T细胞浸润密度增加2.7倍和1.9倍（P<0.000 1），IL-6、TNF-α分泌水平分别升高1.7倍和2.4倍（P<0.000 1），联合抗PD-L1治疗使肿瘤体积抑制率达77.6% （P<0.000 1）。【结论】本研究成功构建了具有代谢-免疫双重调控功能的ECN工程菌平台，通过原位供给光动力治疗前体药物、精氨酸介导的免疫代谢重编程、协同免疫检查点阻断的三重作用，为实体瘤的联合治疗提供了新的解决方案，也为肿瘤微环境精准调控策略的发展提供研究思路。
文章目录
1 材料与方法
1.1 培养基
1.2 主要试剂和仪器
1.3 基因工程改造ECN以构建EALA和EALA △thyA
1.4 体外细胞实验中5-ALA和精氨酸的测定
1.5 对EALA △thyA进行小鼠体内实验
1.6 肿瘤匀浆液制备和CFU计数
1.7 小鼠肿瘤组织5-ALA和精氨酸含量的测定
1.8 CD3免疫组织化学技术
1.9 利用流式细胞术检测肿瘤浸润T细胞
1.10 酶联免疫吸附测定(Enzyme Linked Immunosorbent Assay， ELISA)
1.11 数据分析
2 结果与分析
2.1 构建ECN合成5-ALA和精氨酸
2.2 提高工程菌EALA的肿瘤靶向能力
2.3 EALA △thyA在小鼠体内的抗肿瘤作用
2.4 EALA △thyA与抗PD-L1抗体联合给药并抑制肿瘤生长
3 讨论与结论
