文件大小：1.47M
摘要：旨在探究肉牛胴体胸深性状重要候选基因蛋白激酶D1（PRKD1）基因对牛成骨细胞分化的调控作用。本研究以妊娠3月龄华西牛胎儿肋骨来源成骨细胞为体外模型，根据PRKD1基因序列信息，分别构建合成了过表达PRKD1质粒（pPRKD1）和PRKD1 siRNA（siPRKD1），并将其转染牛成骨细胞并对其进行诱导分化；在分化4 d时，采用RT-qPCR和免疫印迹实验检测成骨分化关键效应基因（RUNX2、SP7、SPP1、COL I）的表达量；在分化7 d时，检测ALP活性；在分化21 d时，用茜素红钙结节染色法检测成骨细胞成骨能力。以上所有实验均设立3个生物学重复，并于组内设立3次组内重复。结果表明，过表达PRKD1后，SP7和COL I的mRNA和蛋白表达量显著性提高（P<0.01），RUNX2和SPP1则未产生显著性差异。过表达PRKD1引起成骨细胞ALP活性显著升高（P<0.01），矿化结节显著增多（P<0.01），而干扰PRKD1则反之。综上，PRKD1基因显著影响牛肋骨成骨细胞的分化和成骨功能，研究结果为进一步解析PRKD1基因调控牛胴体胸深性状的作用机制提供理论依据。
文章目录
1 材料与方法
1.1 试验动物
1.2 主要仪器
1.3 主要试验试剂
1.4 方 法
1.4.1 牛原代成骨细胞的分离培养和诱导分化
1.4.2 牛成骨细胞的鉴定
1.4.3 质粒和siRNA构建
1.4.4 细胞转染及分组
1.4.5 引物设计与合成
1.4.6 Real-time qPCR（RT-qPCR）
1.4.7 免疫印迹试验
1.4.8 试剂盒ALP染色
1.4.9 茜素红染色
1.5 统计学分析
2 结 果
2.1 牛成骨细胞的分离培养
2.2 牛成骨细胞的鉴定
2.3 PRKD1干扰对牛成骨细胞的成骨分化的影响
2.3.1 siPRKD1的干扰效率验证
2.3.2 干扰PRKD1抑制牛成骨细胞成骨分化
2.4 过表达PRKD1对牛成骨细胞的
