摘要：目的 探讨穿心莲内酯（andrographolide,AG）对刚地弓形虫（Toxoplasma gondii）的抑制作用及潜在治疗机制。方法 在人包皮成纤维细胞（HFF）中加入0、5、10、20、40、80、120、160、320μmol/L穿心莲内酯和10μl CCK-8溶液，检测各组细胞的吸光度(A450值)，绘制增殖曲线。将HFF细胞分为二甲基亚砜（DMSO）组、AG组和乙胺嘧啶（PYR）组，分别加入SAG1抗体，绿色荧光标记的羊抗兔IgG抗体（1∶1 000），红色荧光标记的羊抗兔IgG抗体（1∶1 000），光学显微镜下观察弓形虫入侵情况，并计算入侵率。将HFF细胞分为DMSO组、AG组，加入绿色荧光标记的羊抗鼠IgG抗体（1∶1 000），光学显微镜下观察增殖情况。将HFF细胞分为DMSO组、AG组和PYR组，分别加入100μl DMSO、40μmol/L AG和5μmol/L PYR，显微镜下观察空斑面积。采用表面等离子体共振成像（SPRi）技术筛选互作蛋白，链酶蛋白酶降解法验证异戊烯基焦磷酸合成酶基因（IspG）与AG的互作，蛋白质免疫印迹（Western blotting）检测IspG蛋白表达情况。逆转录定量PCR （RT-qPCR）检测互作蛋白基因mRNA相对转录水平。使用GraphPad Prism 8.0.2软件进行统计学分析。结果 CCK-8实验结果显示，在0、5、10、20、40μmol/L AG中HFF细胞相对活力维持在较高水平，无明显毒性；在80、120、160、320μmol/L AG中相对活力分别为57.83%、34.16%、48.25%和30.75%，毒性明显（F=14.96,P <0.01）。间接免疫荧光结果显示，AG组和PYR组入侵率分别为（8.06±2.40）%和（6.36±1.79）%，均低于DMSO组（42.49±9.75）%（F=35.88,P <0.01）。DMSO组平均每个纳虫泡的弓形虫数量约为5.78±0.94个，高于AG组的1.40±0.12个（t=7.98,P <0.01）。空斑实验结果显示，AG组和DMSO组的空斑形成面积分别为3 210±1 840μm2和0μm2，差异有统计学意义（t=19.03,P <0.01）。SPRi鉴定AG与弓形虫的互作蛋白，蛋白质谱评分最高的弓形虫蛋白分子为核糖体RNA加工蛋白、ATP合酶α亚基、异戊烯基焦磷酸合成酶（IspG）和START结构域蛋白，分别为2.19、4.01、4.01和2.12，具有高度的相关性。药物亲和响应靶标稳定性实验结果显示，10μmol/L AG组的IspG蛋白水平为0.25±0.01，显著高于对照组0.12±0.01 （F=294.2,P <0.01）。RT-qPCR结果显示，40μmol/L AG组IspG mRNA的相对转录水平为4.903±1.546，高于DMSO组（1.19±0.20）(t=4.123,P <0.05)。Western blotting检测结果显示，IspG蛋白表达水平呈现明显的浓度依赖性下降趋势：AG 0 （DMSO组）、10、20和40μmol/L的相对蛋白水平分别为0.57±0.01、0.52±0.02、0.24±0.05和0.03±0.01 （F=313.4,P <0.01）。结论 穿心莲内酯通过靶向IspG蛋白，抑制弓形虫的入侵和增殖，具有显著的抗弓形虫活性。
