摘要：【目的】构建表达增强绿色荧光蛋白（enhanced green fluorescent protein， EGFP）报告基因的重组甲型流感病毒，同时研究其体外生物学特性、抗病毒药物筛选和中和抗体检测应用。【方法】采用流感病毒反向遗传学技术在H1N1-PR8病毒NA基因的C端插入EGFP基因，成功构建并拯救了重组甲型流感病毒，命名为PR8NAEGFP/WSN。采用RT-PCR与测序分析EGFP插入位置的准确性和遗传稳定性；通过EGFP报告基因表达、复制动力学和空斑形态鉴定重组病毒（PR8NAEGFP/WSN）和对照病毒（PR8NA/WSN，无EGFP插入）；采用病灶形成试验（focus-forming assay， FFA）、qPCR、EGFP荧光检测，评价流感病毒阳性药物法匹拉韦的体外抗病毒药效；同时采用病灶减少中和试验（focus reduction neutralization test， FRNT）和报告基因活性检测，应用于IAV中和抗体检测。【结果】结果表明，重组病毒（PR8NAEGFP/WSN）在鸡胚中经过五代盲传后保持遗传稳定。与PR8NA/WSN相比，该重组病毒在48 h测得的病毒滴度略低，结晶紫噬斑形态与对照病毒相似。采用重组病毒测得法匹拉韦的EC50与对照病毒一致，且通过FFA、qPCR和EGFP荧光等多种检测方法所得的EC50值之间均具有良好的相关性。FRNT和EGFP荧光测定的中和抗体滴度相关系数r为0.930 4，结果具有良好的一致性。【结论】携带报告基因的重组流感病毒为IAV的基础研究、抗病毒药物和疫苗评价提供了实时可视化的工具。
文章目录
1 材料与方法
1.1 细胞、质粒与血清
1.2 PR8NAEGFP/WSN病毒构建与拯救
1.3 RT-PCR鉴定
1.4 法匹拉韦体外抗病毒药效试验
1.5 GFP荧光强度检测
1.6 病灶形成试验
1.7 病灶减少中和试验(focus reduction neutralization test， FRNT)
1.8 荧光定量PCR
1.9 结晶紫噬斑试验
1.10 统计分析
2 结果与分析
2.1 PR8NAEGFP/WSN病毒构建与验证
2.2 PR8NAEGFP/WSN病毒具有遗传稳定性
2.3 PR8NAEGFP/WSN和PR8NA/WSN病毒的体外生物学特性
2.4 PR8NAEGFP/WSN病毒在体外抗流感病毒药效学评价中的应用
2.5 PR8NAEGFP/WSN病毒在体外应用于中和抗体检测
3 讨论与结论
