摘要：目的:使用腺相关病毒载体-9（adenoassociatedviralvectors，AAV9）搭载不同的肝特异性启动子，构建基因治疗药物递送系统，用于治疗Wilson病动物模型。观察该基因治疗方法对疾病模型的治疗效果，并比较不同肝特异性启动子介导的治疗效应差异。方法:以野生型C57BL/6作为正常组，将Atp7b-/-小鼠随机分为模型组、AAV9-AATb-空白转染、AAV9-CMVb-空白转染、AAV9-CMVb-mATP7b、AAV9-AATb-mATP7b、AAV9-AAT-mATP7b共7组，每组5只。正常组及模型组不予药物，其余组给与AAV9-AATb-EGFP、AAV9-CMVb-EGFP、AAV9-CMVb-mATP7b、AAV9-AATb-mATP7b、AAV9-AAT-mATP7b药物，剂量为200 Ul／20 g。给药方式为尾静脉注射给药，分别在给药后的第1、2、3个月后取材。采用生化法、电感耦合等离子体-质谱法（Inductivelycoupledplasma-MassSpectrometry，ICP-MS）、实时荧光定量PCR、WesternBlot法HE染色等检测各组小鼠血清学指标、肝脏铜含量、病理改变、ATP7b（Copper-transporting P-type ATPase，ATP7b）及铜蓝蛋白（Ceruloplasmin，CP）的基因和蛋白的表达水平。结果:与正常组比较，模型组肝组织铜含量升高（P<0.05），血清丙氨酸氨基转移酶（alanineaminotransferase，ALT）、天冬氨酶转移酶（aspartateaminotransferase，AST）水平上升，肝组织局部坏死伴炎性细胞浸润，ATP7b及CP的mRNA和蛋白表达水平下降。与模型组比较，AAV9-CMVb-mATP7b组ATP7b的mRNA及蛋白相对表达在3个时间段均升高（P＜0.01），血清ALT、AST水平在治疗后第1、2个月时下降（P＜0.01），肝脏病理损伤在第１、2个月时改善，炎性细胞数稍降低（P<0.01），肝组织铜含量在治疗后第2、3月时降低（P＜0.01）；AAV9-AATb-mATP7b小鼠在治疗后的3个时间段，均可见肝组织铜含量降低（P＜0.01）、血清ALT、AST水平下降（P＜0.01）、病理损伤均改善明显、ATP7b和CP的相对表达明显升高（P＜0.01，P＜0.05）；AAV9-AAT-mATP7b组ATP7b的相对表达在3个时间段均升高（P＜0.01），血清ALT、AST 水平在给药第1、2月时下降（P＜0.01），第2个月时肝铜含量降低（P＜0.01），病理损伤轻度缓解，仍可见肝细胞排列紊乱，胞核增大。结论:AAV9可以作为Wilson病药物递送载体且治疗方式有效，AAV9-mATP7b药物单次给药后，其蛋白可持续表达至少3个月，其中带有肝脏特异性启动子的药物AAV9-AATb-mATP7b在治疗Wilson病时效果最佳且持续稳定。
文章目录
1 材料与方法
1.1 实验动物
1.2 主要试剂及仪器
1.3 分组及给药
1.4 Atp7b-/-小鼠基因鉴定
1.5 药物制备
1.6 荧光显微镜检测
1.7 ICP- MS法
1.8 血清生化法
1.9 HE 染色检测小鼠肝脏病理学改变
1.10 实时荧光定量 PCR 法
1.11 Western Blot法
1.12 统计学分析
2 结果
2.1 AAV9药物可有效转染至Atp7b-/-小鼠体内
2.2 AAV9药物可有效降低Atp7b-/-小鼠肝铜含量
2.3 AAV9药物可改善Atp7b-/-小鼠肝功能
2.4 AAV9药物可改善Atp7b-/-小鼠肝脏病理损伤
2.5 AAV9药物可提高Atp7b-/-小鼠肝脏中ATP7b的相对表达
2.6 各组小鼠铜蓝蛋白在血清和肝
