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摘要：利用CRISPR/Cas9系统构建了METTL3基因敲除细胞系(BHK-21)，随后用口蹄疫病毒(FMDV)分别感染野生型和METTL3敲除BHK-21细胞，通过qPCR、Western-blot和TCID50方法检测FMDV在上述两株细胞中的复制情况。结果表明，敲除METTL3显著抑制FMDV的复制。为了进一步验证METTL3的表型功能，利用慢病毒包装系统构建了METTL3稳定表达细胞系。用FMDV分别感染野生型和METTL3过表达BHK-21细胞，通过qPCR和TCID50试验测定了FMDV在这2株细胞中的复制情况。结果显示，过量表达METTL3促进FMDV的复制。此外，激光共聚焦显微镜试验显示，FMDV感染BHK-21细胞后，METTL3从细胞核迁移至细胞质，其细胞定位的改变表明METTL3可能参与调控FMDV基因组的转录过程。本研究中成功构建了METTL3基因敲除和过表达的BHK-21细胞系，首次发现该分子正向调控FMDV的复制。上述实验结果为进一步开展METTL3在宿主细胞中调控FMDV复制的机制研究奠定了可靠的数据基础。
文章目录
1 材料与方法
1.1 细胞、病毒及质粒
1.2 试剂及抗体
1.3 引物的设计
1.4 慢病毒重组质粒lentiCRISPR-METTL3-sgRNA、过表达质粒plov-METTL3的构建
1.5 慢病毒包装及感染待建系细胞
1.6 细胞接毒感染
1.7 实时荧光定量PCR
1.8 蛋白的Western-blot检测
1.9 TCID50测定分析
1.10 免疫荧光
2 结果
2.1 sgRNA重组表达质粒的构建与鉴定
2.2 METTL3基因敲除细胞系的初步应用
2.2.1 敲除METTL3抑制FMDV的复制
2.2.2 过表达METTL3促进FMDV的复制
2.3 FMDV基因组中m6A甲基化修饰位点的预测
2.4 METTL3对FMDV复制影响的初步研究
3 讨论
