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摘要：【目的】以果聚糖蔗糖酶（sucrose-6-fructosyltransferase， SacB）为基础的双交换同源重组技术虽常用于革兰氏阴性菌的基因组编辑，但其负筛选效率在不同菌株之间常存在显著的差异，部分菌株因代谢特性或基因组组成差异导致效率低下。本研究旨在构建一种基于VI型分泌系统（T6SS）效应蛋白Txe1的新型负筛选体系，以提高无痕基因组编辑的效率。【方法】首先对传统自杀质粒pDM4进行改造，引入卡那霉素抗性基因，获得衍生质粒pDM4K；随后以阿拉伯糖诱导型Txe1毒素C端结构域表达盒(araC-PBAD::txe1CTD)取代质粒中的sacB基因，构建新型负筛选质粒pTL1010。以杀鱼爱德华氏菌FC2株毒力相关基因tssB为编辑靶点，系统评估了Txe1系统与传统SacB系统在负筛选效率方面的差异。【结果】在阿拉伯糖诱导条件下，Txe1毒素系统的负筛选效率达到91.1% （假阳性率8.9%），显著优于传统SacB系统（假阳性率100%，P<0.01）。【结论】本研究开发的新型Txe1负筛选质粒pTL1010显著提高了杀鱼爱德华氏菌的无痕基因编辑效率，为革兰氏阴性菌精准遗传操作提供了高效的新工具。
文章目录
1 材料与方法
1.1 菌株与培养条件
1.2 主要试剂
1.3 引物设计及合成
1.4 自杀质粒pTL1010的构建及验证
1.4.1 pDM4K载体的构建
1.4.2 pTL1010载体的构建
1.4.3 pTL1010质粒的构建策略
1.5 比较pDM4K和pTL1010在杀鱼爱德华氏菌基因敲除中的应用
1.5.1 同源重组质粒的构建
1.5.2 质粒接合转移及同源重组双交换
1.6 敲除株的毒力表型验证
1.7 统计分析
2 结果与分析
2.1 pTL1010质粒的毒素诱导表达表型验证
2.2 第一次同源重组效率比较
2.3 第二次同源重组效率比较
2.4 ΔtssB的毒力表型
3 讨论与结论
