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摘要：【目的】探究单核增生李斯特氏菌（Listeria monocytogenes）通过毒力因子溶血素O （listeriolysin O， LLO）调控线粒体Ca2+摄取蛋白2 （ MICU2）表达及其互作关系，进而影响线粒体钙稳态和细菌胞内增殖的分子机制。【方法】采用Western blotting检测单核增生李斯特氏菌EGD-e和Δhly感染HeLa细胞后MICU2的表达变化。采用基因沉默技术和真核过表达技术，探究MICU2蛋白水平变化对单核增生李斯特氏菌胞内增殖能力的影响。利用AlphaFold3预测LLO与MICU2的互作位点，并通过Co-IP验证其相互作用。结合线粒体钙荧光探针（Rhod-2 AM）分析MICU2对钙稳态的调控作用。【结果】EGD-e感染4 h和6 h后显著上调MICU2表达（P<0.001），而Δhly感染后MICU2的表达量无显著变化（P>0.05）。沉默MICU2增强细菌增殖能力（P<0.01）并升高线粒体钙水平（P<0.05）。过表达MICU2则减弱细菌增殖能力（P<0.01）并降低线粒体钙水平（P<0.05）。AlphaFold3预测LLO第462位丙氨酸（Ala）与MICU2第119位谷氨酸（Glu）通过氢键结合，Co-IP证实二者存在相互作用。【结论】本研究表明，单核增生李斯特氏菌通过LLO上调MICU2表达，MICU2通过减少线粒体钙抑制细菌胞内增殖，LLO与MICU2的互作是此过程的关键分子基础。本研究为深入探究单核增生李斯特氏菌的致病机理提供了参考。
文章目录
1 材料与方法
1.1 菌株、质粒及细胞株
1.2 主要试剂
1.3 真核细胞总RNA提取及cDNA的制备
1.4 MICU2真核表达载体的构建与鉴定
1.5 Western blotting检测单核增生李斯特氏菌感染后HeLa细胞内MICU2蛋白表达
1.6 MICU2沉默或过表达后单核增生李斯特氏菌在HeLa细胞内的胞内增殖试验
1.7 Alphafold3预测LLO与MICU2互作
1.8 免疫共沉淀试验(Co-IP试验)分析LLO与MICU2互作
1.9 流式细胞术检测线粒体钙离子水平
1.10 数据统计与分析
2 结果与分析
2.1 MICU2真核表达载体的构建及验证结果
2.2 单核增生李斯特氏菌感染HeLa细胞后MICU2的蛋白表达水平显著升高
2.3 MICU2过表达后单核增生李斯特氏菌在HeLa细胞内的胞内增殖能力显著降低
2.4 MICU2沉默后单核增生李斯特氏菌在HeLa细胞内的胞内增殖能力显著升高
2.5 MICU2与LLO之间存在相互作用
2.6 单核增生李斯特氏菌感染MICU2沉默或过表达的HeLa细胞后线粒体钙离子水平检测
3 讨论与结论
作者贡献声明
