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摘要：基于Wnt家族成员3a（Wnt3a）/Yes相关蛋白（YAP）/酰基辅酶A合成酶长链家族成员4（ACSL4）通路探讨独活寄生汤对髓核细胞铁死亡及椎间盘退变（IDD）大鼠模型的保护作用及机制。体外实验中将25只SD大鼠随机分为5组，分别给予蒸馏水，低、中、高剂量(4.9、9.8、19.6 g·kg-1)独活寄生汤和塞来昔布(0.02 g·kg-1)，连续灌胃7 d后取血清。采用白细胞介素（IL）-1β诱导髓核细胞退变，研究独活寄生汤含药血清对髓核细胞增殖及凋亡的影响。采用CCK-8法和EdU法检测细胞活力与增殖，Annexin V-FITC/PI 双染法检测细胞凋亡。为探究Wnt3a/YAP/ACSL4通路的作用，同时加入Wnt3a/β-连环蛋白（β-catenin）信号通路激动剂SKL2001干预。采用蛋白免疫印迹（Western blot）法检测髓核细胞中Wnt3a、磷酸化糖原合成酶激酶3β（p-GSK3β）、磷酸化β-连环蛋白（p-β-catenin）、β-catenin、YAP、ACSL4和谷胱甘肽过氧化物酶4（GPX4）蛋白表达，免疫荧光法检测β-catenin、YAP、Ⅱ型胶原蛋白（collagen Ⅱ）和基质金属蛋白酶13（MMP-13）表达，比色法检测丙二醛（MDA）含量，JC-1法检测线粒体膜电位，透射电子显微镜（TEM）观察线粒体超微结构变化。体内实验中将SD大鼠随机分为假手术组、模型组、独活寄生汤(19.6 g·kg-1)组及塞来昔布(0.02 g·kg-1)组，建立针刺诱导的IDD模型，干预21 d后对大鼠造模节段尾椎行核磁共振成像（MRI），采用Pfirrmann分级评估椎间盘退变程度，苏木素-伊红（HE）染色和茜素红染色观察大鼠椎间盘组织学变化;Western blot检测髓核组织中Wnt3a、p-GSK3β、β-catenin、YAP和ACSL4蛋白表达。结果显示，独活寄生汤含药血清干预呈剂量依赖性促进髓核细胞增殖、增强细胞活力，并抑制细胞凋亡。与IL-1β组相比，独活寄生汤含药血清显著抑制髓核细胞中Wnt3a、p-GSK3β、β-catenin、YAP和ACSL4蛋白表达，并促进GPX4蛋白表达；减少β-catenin和YAP蛋白核转位；增加collagen Ⅱ的表达，减少MMP-13的表达；降低MDA含量，提高JC-1聚合体与单体荧光强度比值，改善线粒体结构；然而SKL2001干预削弱了上述保护作用。与模型组相比，独活寄生汤和塞来昔布均能降低IDD大鼠椎间盘Pfirrmann等级和组织学评分，并下调Wnt3a、p-GSK3β、β-catenin、YAP和ACSL4蛋白水平。综上，独活寄生汤可能通过调节Wnt3a/YAP/ACSL4通路，抑制髓核细胞铁死亡和细胞外基质降解，从而改善IDD。
文章目录
1材料
1.1 动物
1.2 细胞
1.3 试剂
1.4 仪器
1.5 药物
2方法
2.1含药血清制备
2.2细胞鉴定、培养及分组
2.3体外实验
2.3.1CCK-8法检测细胞活力
2.3.2Annexin V-FITC/PI 双染法检测细胞凋亡
2.3.3EdU法检测细胞增殖
2.3.4Western blot检测髓核细胞中Wnt3a、p-GSK3β、p-β-catenin、β-catenin、YAP、ACSL4和GPX4蛋白表达
2.3.5免疫荧光法检测测髓核细胞中β-catenin、YAP、collagen Ⅱ和MMP-13蛋白表达
2.3.6MDA含量的检测
2.3.7JC-1法检测线粒体膜电位
2.3.8透射电子显微镜（TEM）观察髓核细胞线粒体超微结构
2.4体内实验
2.4.1动物造模及给药
2.4.2MRI观察大
